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            細胞培養注意事項

            發布時間:2019-12-28 10:02

            1.實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌,以70 %ethanol擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以70%ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。

            2.無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。

            3.小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

            4.工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中,應避免引起aerosol之產生,小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等,并避免尖銳針頭之傷害等。

            5.定期檢測下列項目:

            (1)CO2 鋼瓶之CO2壓力。
            (2)CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。
            (3)無菌操作臺內之airflow壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000小時/HEPA)。

            6.水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。

            7.關于工作濃度的胰酶是不是應保存在-20度?如果放在4度冰箱可以保存多久?是不是幾個小時就會失去活性?

            平時放在-20度,分裝在50毫升螺口管,用時拿一管放4度用。

            8.認真按照操作規程進行實驗,一般不大會導致污染,很多情況下是由于所用的試劑或培養基有污染而使實驗失敗,

            9.粉末培養基配制好后(加了血清),一般在4度盡量不要超過1個月,如在-20度存放時間可長一些,但最好也不要超過3-4個月,可能對于永生化細胞株來說要求不是太高,但我在過去的4年里一直是作原代細胞培養的,細胞嬌弱,經驗表明放置時間不宜過長。

            10.關于實驗用品的清洗與消毒,我的經驗是:用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上,然后加少許清洗劑,以超聲波洗滌30min左右,(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈),撈出晾干,再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后,自來水清洗10-15遍,雙蒸水清洗3-4遍,晾干,高壓消毒后即可使用。

            許多塑料制品也可以高壓消毒,例如培養瓶蓋,膠塞,吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了,當然如果money有限,如進口的培養板、皿等,也可以重復使用1-2次,我當時使用方法是將其完全清潔后,使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可,我做過多次,沒有出現問題。塑料培養瓶由于清洗消毒不便,最好不要重復使用,如一定要重復用,可用環氧乙烷等消毒,(消毒后一定要放置半年以上方可使用) 。

            在光鏡下,上皮細胞通常呈“鋪路石”樣排布,細胞之間有拉絲現象(即距離較遠的細胞可以通過細長的觸手相連),細胞有成片生長的特性。而間質細胞通常呈梭形,沒有有成片生長的特性,細胞之間的聯系不緊密。但是細胞的形態特征會因為生長條件的改變而改變,如HeLa細胞是上皮細胞,但是在酸性培養條件下會變為梭形。

            上皮細胞之間都有特征性的緊密連接(橋粒)結構,因此可以通過觀察培養細胞的超微結構來判斷細胞的類型,如果有緊密連接,就必然是上皮細胞。這是一錘定音的證據。注意不要把細胞消化下來做電鏡,要用細胞刮刮下來后做電鏡。 此外每一種上皮細胞都有其特征的細胞角蛋白的表達(cytokertin,CK),可以查一下子宮內膜腺上皮細胞表達的CK分子,然后進行免疫細胞化學的鑒定。

            細胞在偏堿的情況下培養,耐受能力會逐漸下降,可能是產生脫壁現象的原因,后來我重新測了一下培養基,為7.5左右,我用滅菌的HCL調了一下,培養基顏色變成淡紅透亮,再次培養,發現細胞貼壁比較好了,搏動效果也不錯,因此,我以后每次培養前都要重新調好PH值,我覺得很多因素是能影響PH值的。

            血清質量不好,影響了細胞生長。所以,我認為以后養細胞,用的血清濃度最好是每批次血清都摸一下,不一定要以參考文獻為準,畢竟國產的血清質量差異比較大啊。

            細胞無菌操作是關鍵,對于配制培養液時,有些人為了讓培養粉充分溶解,攪拌4小時或更長時間。其實這完全沒有必要,一般培養基的固體組分還是易溶于水的,攪拌的時間長了會增加污染機會,雖然后來濾過除菌了,但細菌的代謝產物比如脂多糖誰能夠把它濾掉?細菌的代謝是很快的,甚至在常溫下20min就可以繁殖一代,太可怕了。我的經驗就是攪拌30min-60min就把它過濾。

            另外關于培養基的pH問題,一般按照說明書操作,加入所說的NaHCO3量,與預計的pH不會有什么距離,也就是說基本上不用調pH,如果相差大,要考慮三蒸水的質量是否有所下降,當然這時調pH也是不得已而為之。我配培養基時基本上不調pH,只是用試紙檢測一下pH,觀察一下培養基的顏色。

            我司有微生物培養專用的培養箱,感興趣的可以給我們來電哦。


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